ФУДАМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА

Механізми протипухлинної активності,
зумовленої гепарином, згідно з експериментальними моделями раку

Скорочений виклад

T. M. H. Niers, C. P. W. Klerk, M. DiNisio, C. J. F. Van Noorden et al.
Crit. Rev. Oncol./Hematol. 2007;61(3):195–207

1. Вступ

Хоча зв’язок між тромбозом та раком загальновизнаний, вплив системи згортання крові на прогноз перебігу злоякісного захворювання докладно не вивчений. Протягом багатьох років висувалися гіпотези про критичну роль, яку відіграють активовані фактори згортання крові в біології раку, підтверджені клінічними дослідженнями гепаринів та доклінічними дослідженнями на пухлинних моделях in vivo та in vitro.

Позитивний вплив НМГ на виживання підтверджено системним оглядом 9 досліджень лікування венозної тромбоемболії (Hettiarachchi R. J. et al., 1999), яким встановлено зниження 3-місячної смертності на 49% при лікуванні НМГ на противагу НФГ.

Зниження смертності виявлено при різних видах раку, цей феномен не зумовлений відмінностями в частоті смертельної ВТЕ або кровотечі і на нього не впливають інші прогностичні змінні.

Для оцінки впливу НМГ та НФГ на виживання онкологічних хворих проведено проспективні рандомізовані дослідження. Von Tempelhoff G. F. та Heilmann L. (2000) вивчали показники виживання в пацієнтів, яким у післяопераційному періоді вводили НМГ або НФГ у профілактичних дозах протягом 7 днів. Серед 324 хворих, прооперованих з приводу раку грудної залози або органів таза, смертність у групі НМГ становила 5,7% на противагу 15,6% у групі НФГ (p = 0,005).

Lee A. Y. et al. (2003) рандомізували 676 онкологічних хворих з ВТЕ на лікування дальтепарином* або антагоністами вітаміну К. Різниці в 1-річному виживанні між обома групами не виявлено. Проте за допомогою апостеріорного аналізу доведено, що у хворих без метастатичного ураження 1-річна смертність була значно нижчою у групі дальтепарину (20%), ніж у групі антагоністів вітаміну К (35%) (p = 0,03). Ця різниця не була пов’язана з відмінностями в частоті смертельного тромбозу.

Під час нещодавніх досліджень (FAMOUS та MALT) вивчали вплив НМГ на виживання онкологічних пацієнтів без ВТЕ. Під час дослідження FAMOUS (Kakkar A. K. et al., 2004) 385 хворих з раком рандомізували на лікування дальтепарином (Фрагміном) у низьких дозах (5000 МО/день) або плацебо протягом 1 року. Достовірної різниці у виживанні між обома групами не виявлено. Проте в підгрупі хворих з відносно сприятливим прогнозом на момент їх включення в дослідження лікування дальтепарином супроводжувалося тривалішим середнім виживанням (24 місяці на противагу 43 місяцям; p = 0,03). Проведено два дослідження для вивчення впливу НФГ (Lebeau B. et al., 1994) та НМГ (Altinbas M. et al., 2004) на пацієнтів з дрібноклітинним раком легенів, під час яких виявлено статистично достовірну перевагу щодо виживання хворих, рандомізованих у групу хіміотерапії з додатковим призначенням НФГ або НМГ, порівняно з групою виключно хіміотерапії.

Хоча результати клінічних досліджень однозначно доводять протиракову активність гепаринів, особливо НМГ, багато запитань залишаються без відповіді. Не відомі механізми, за допомогою яких НМГ проявляють протипухлинну активність навіть після короткотермінового лікування. Не встановлено, чи протипухлинна активність НМГ зумовлена виключно їх антикоагуляційною дією, чи ці препарати впливають ще й на інші біологічні процеси.

У нашому дослідженні ми вивчили докази щодо впливу гепаринів на рак згідно з результатами експериментальних досліджень на тваринних моделях.

2. Гепарини

2.1. Гепарини та низькомолекулярні гепарини

Гепарин належить до сімейства глікозаміногліканів. Ці довгі молекули містять нерозгалужені дисахаридні повтори і містяться переважно на мембрані клітин та в позаклітинному матриксі. Гепарин міститься у великій кількості у гранулах тучних клітин. Виділення гепарину з цих гранул у кровообіг у відповідь на ушкодження приводить до пригнічення тромбоутворення.

НФГ, який застосовується клінічно, представлений природними глікозаміногліканами свинячого або коров’ячого походження з молекулярною масою в межах 12 000–14 000 дальтон. НМГ отримують з НФГ методом хімічної або ферментної деполімеризації, їх фрагменти становлять приблизно третину від розміру молекули гепарину (молекулярна маса приблизно 5000 дальтон).

Антитромботична активність гепарину проявляється завдяки взаємодії з антитромбіном. Комплекс гепарин-антитримбін зв’язується з активованим X фактором згортання, таким чином інактивуючи його. Активність проти фактору Xa в НФГ та НМГ однакова.

Відмінність між НФГ та НМГ полягає у відносній інгібіторній активності проти фактору Xa та IIa. Фактор IIa інактивується трикомпонентним комплексом, який складається з гепарину, антитромбіну та фактору IIa. Для утворення цього комплексу в молекулі гепарину необхідна 18-сахаридна послідовність. Більшість ланцюгів НМГ надто короткі, щоб утворювати такий комплекс. Тому НМГ порівняно з НФГ характеризуються відносно низькою активністю проти фактору IIa.

Крім антитромбіну, НФГ та НМГ можуть з’єднуватися з різноманітними білками і на додаток до антикоагулянтної дії проявляти широкий спектр іншої біологічної активності.

3. Вплив гепаринів на ріст експериментальних первинних пухлин та їх метастазування

У цьому огляді ми окремо розглядаємо вплив гепаринів на первинні пухлини або наявні метастази і на здатність до метастазування клітин, введених за допомогою інфузії.

3.1. Вплив гепаринів на ріст первинних пухлин або наявних метастазів

Для вивчення впливу гепаринів на підшкірно імплантовані або хімічно викликані пухлини у тварин проведено 17 досліджень. Тільки в 4 з них за допомогою лікування гепаринами досягнуто достовірного зменшення об’єму первинної пухлини. Дія гепарину не залежала від методу індукції пухлини на різних тваринних моделях, а також від інтервалу між початком лікування гепарином та індукцією пухлини. На ефект гепаринотерапії впливали такі фактори, як доза, вид гепарину та тривалість лікування. Високі дози гепарину (100 ОД тричі на день протягом 15 днів) виявилися ефективними (Back N. et al., 1976; Ohkoshi M. et al., 1993), хоча результати не завжди були однозначними (Owen Jr. C. A., 1982). Гепарини в низьких дозах або при лікуванні тривалістю менш як 15 днів, а також введення дуже високих доз гепарину (200 ОД) тільки тричі на тиждень (Chan S. Y. et al., 1980) не впливали на ріст пухлини. Імовірно, що для впливу на ріст первинної пухлини гепарини слід вводити тривалий час у високих дозах.

Отже, отримані дані вказують на те, що згідно з різними пухлинними моделями ріст первинних пухлин можуть пригнічувати тільки високі дози гепарину та деякі хімічно модифіковані гепарини. Важливість призначення гепарину у високих дозах підтверджена дослідженнями на моделях з внутрішньоочеревинними пухлинами. У 6 з 7 досліджень (Goldstein D. S. et al., 1993; Jacobi C. A. et al., 1997, 1999; Neuhaus S. J. et al., 1999; Pross M. et al., 2003, 2004) встановлено зменшення кількості випадків імплантації пухлини в черевній порожнині при введенні туди гепарину. Це може вказувати на те, що необхідно створювати високу концентрацію гепарину навколо пухлинних клітин. Оскільки модифіковані гепарини з обмеженою або відсутньою антикоагуляційною активністю також проявляють протипухлинну дію, цей вплив не залежить виключно від пригнічення згортання крові.

3.2. Вплив гепаринів на розвиток метастазів

Більшість випадків смерті від раку зумовлені радше метастазами, ніж первинними пухлинами. Тому можна запропонувати гіпотезу, що вплив гепаринів на прогноз перебігу ракового захворювання частково або повністю зумовлений запобіганням гематогенному метастазуванню.

У період між 1985–2005 рр. було проведено 17 досліджень, під час яких вивчали вплив гепарину на первинні (вісцеральні метастази після внутрішньовенного введення злоякісних клітин) та вторинні метастази (вісцеральні метастази після підшкірної інокуляції ракових клітин). У 14 з цих досліджень гепарин приводив до достовірного зменшення кількості метастазів (Drago J. R. et al., 1985; Milas L. et al., 1985; Irimura T. et al., 1986; Beuth J. et al., 1987; Lee A. E. et al., 1988, 1990; Sciumbata T. et al., 1996; Miao H. Q. et al., 1999; Borsig L. et al., 2001; Ono K. et al., 2002; Poggi A. et al., 2002; Amirkhosravi A. et al., 2003; Stevenson J. L. et al., 2005; Bereczky B. et al., 2005).

Інтервал між введенням гепарину та внутрішньовенною інокуляцією злоякісних клітин має клінічне значення, оскільки внутрішньовенний контакт цих клітин з гепаринами або дія гепаринів можуть впливати на здатність клітин до виживання та ендотеліальної адгезії — факторів, необхідних для успішного метастазування. Антиметастатична активність гепаринів виявлена під час 10 досліджень, під час яких гепарин вводили безпосередньо перед внутрішньовенною інокуляцією пухлинних клітин.

4. Механізми протиракової активності, зумовленої гепарином

Експериментальні дослідження, які ми проаналізували, вказують на те, що гепарини радше пригнічують метастазування, ніж ріст пухлини. Гематогенне метастазування — складний процес, під час якого ракові клітини від’єднуються від первинної пухлини, мігрують через стінку судин у кровообіг, розносяться по всьому організмі, приєднуються до ендотеліоцитів та пенетрують у довколишні тканини. Під час внутрішньосудинної фази ракові клітини надзвичайно чутливі до дії захисних механізмів організму і лише обмежена кількість злоякісних клітин з тих, які потрапили у кровообіг, можуть зумовлювати розвиток метастазів і врешті-решт призводити до смерті.

Більшість експериментальних досліджень метастазування полягають у введенні пухлинних клітин у хвостову вену тварини, що призводить до утворення метастазів пухлини в легенях. Більш як 90% злоякісних клітин затримуються в судинах легенів відразу після ін’єкції у хвостову вену (Im J. H. et al., 2004) незалежно від стану гіпокоагуляції або дефіциту фібриногену, після чого ці клітини відразу зумовлюють підвищене згортання крові та внутрішньосудинне відкладення фібрину. У локальній активації системи згортання крові та утворенні згустка, який містить фібрин та пухлинні клітини, важливу роль відіграє тканинний фактор (ТФ), на поверхні ракових клітин часто спостерігається підвищена його експресія. Швидке зниження кількості тромбоцитів після внутрішньосудинного введення пухлинних клітин, очевидно, зумовлене накопиченням тромбоцитів у згустку. Згортання крові та активація тромбоцитів, спричинені пухлинними клітинами, можуть подовжувати виживання цих клітин у судинах легенів. У цих тромбоцитарно-фібринових комплексах пухлинні клітини можуть внутрішньосудинно рости чи гинути або прикріплюватися до ендотеліальної стінки судин, згодом викликаючи інвазію в паренхіму легенів. Останньому процесу сприяє локальне утворення тромбіну, активація тромбоцитів під дією тромбіну та локальне виділення тромбоцитами факторів, які сприяють ангіогенезу (фактор росту судинного ендотелію, ФРСЕ) та проліферації (тромбоцитарний фактор 4). Активація тромбоцитів, зумовлена тромбіном, призводить до активації інтегринового рецептора GP IIb/IIIa на мембрані тромбоцитів, це сприяє з’єднанню тромбоцитів з фібриногеном та виділенню P-селектину з α-гранул. Підвищений рівень P-селектину на поверхні тромбоцитів та ендотеліоцитів сприяє з’єднанню цих клітин з аберантними вуглеводами, які містяться на поверхні мембрани ракових клітин (Kim Y. J. et al., 1998). Ці дані вказують на те, що активація тромбоцитів та утворення фібрину — важливі механізми, за допомогою яких пухлинні клітини сприяють гематогенному метастазуванню. Дослідженнями Camerer E. et al. (2004), Karpatkin S. et al. (1988), Cohen S. A. et al. (2000), Amirkhosravi A. et al. (2003) встановлено, що низький рівень тромбоцитів або пригнічення їх активації приводять до зниження здатності пухлинних клітин до метастазування. Основна проблема застосування антитромбоцитарних препаратів при раку полягає у відсутності селективної дії цих медикаментів. Усі наявні антитромбоцитарні засоби впливають як на гемостаз, так і на активацію тромбоцитів під впливом ракових клітин.

Потенційний вплив гепаринів на процес метастазування такий: антикоагулянтна дія; пригнічення взаємодії між раковими клітинами, тромбоцитами та ендотелієм під час внутрішньосудинної дисемінації раку; інгібування гепаранази; конкурування з фактором росту у приєднанні до гепарансульфатпротеогліканів.

4.1. Вплив на згортання крові

Активація системи згортання крові, пов’язана із наявністю пухлини, сприяє утворенню строми пухлини та розвитку метастазів. Більшість солідних пухлин містять значну кількість білків, які походять від фібриногену; це вказує на те, що фібрин відіграє важливу роль в утворенні строми пухлин (Dvorak H. F. et al., 1992; Costantini V. et al., 1993). Хоча гіпотеза, що протиракова активність гепаринів зумовлена пригніченням утворення фібрину, приваблива, зібрано лише обмежену кількість доказів, що гепарини прямо впливають на ріст пухлини. Фактори згортання крові, крім участі в утворенні строми пухлини за рахунок фібрину, також можуть сприяти метастазуванню. Фібрин(оген) сприяє утворенню метастазів, подовжуючи виживання ракового ембола в судинах (Palumbo J. S. et al., 2000). У мишей з дефіцитом фібриногену порівняно з нормальними мишами після внутрішньовенного введення ракових клітин частота легеневих метастазів була суттєво зниженою. Згідно з цією ж експериментальною моделлю специфічний інгібітор тромбіну гірудин ще більше знижував здатність циркулюючих злоякісних клітин до утворення метастазів; це вказує на те, що тромбін сприяє метастазуванню частково завдяки фібриноген-незалежному механізму. Гепарини можуть взаємодіяти з механізмами метастазування, які залежать від факторів згортання крові. Виявлено, що гепарини скорочують час перебування ракових клітин у легенях і таким чином знижують здатність до утворення метастазів, вони також пригнічують утворення тромбіну та фібрину і завдяки інгібуванню синтезу та активності тромбіну пригнічують активацію тромбоцитів.

Важливий аспект активації системи згортання крові полягає в експресії тканинного фактору (ТФ) на поверхні ракових клітин. Експресія ТФ пригнічується інгібітором зовнішнього шляху згортання крові (ІЗШЗК), який залежить від фактору Xa. ІЗШЗК синтезується головним чином судинними ендотеліоцитами (Sandset P. M. et al., 1991), цей фактор може пригнічувати ріст метастазів у мишей, що вказує на роль тромбіну у процесі метастазування. Оскільки гепарини також можуть викликати виділення ІЗШЗК, який знижує прокоагулянтну активність ракових клітин (Mousa S. A. et al., 2004), можна вважати, що ІЗШЗК — одна з мішеней протипухлинної дії гепаринів.

Оскільки деякими дослідженнями (Irimura T. et al., 1986; Yoshitomi Y. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996, Ono K. et al., 2002; Poggi A. et al., 2002) доведено, що гепарини з відсутністю антикоагулянтної дії також можуть пригнічувати розвиток метастазів, у цьому процесі важливу роль можуть відігравати інші властивості гепаринів, не пов’язані з системою згортання крові.

Наприклад, гепарини з відсутністю антикоагулянтної дії потенційно можуть викликати виділення ІЗШЗК з судинного ендотелію, а ІЗШЗК викликає антиметастатичний ефект частково незалежно від системи згортання крові, діючи як інгібітор ангіогенезу (Hembrough T. A. et al., 2003).

4.2. Вплив на селектини

Під час доклінічних досліджень зібрано чимало доказів того, що взаємодія між раковими клітинами та тромбоцитами сприяє внутрішньосудинному виживанню та прикріпленню злоякісних клітин до поверхні ендотелію (Gasic G. J., 1984; Honn K. V. et al., 1992; Nieswandt B. et al., 1999). Комплекси, які складаються з тромбоцитів та ракових клітин, утворюють щит, який захищає їх від знищення імунокомпетентними клітинами та сприяє адгезії злоякісних клітин до ендотелію судин (Borsig L. et al., 2001). Цій взаємодії між раковими клітинами, тромбоцитами та ендотеліоцитами сприяє з’єднання глікопротеїнів на мембрані злоякісних клітин з селектинами на поверхні тромбоцитів та ендотелію.

Селектини — рецептори адгезії, які розпізнають атипові вуглеводневі молекули на поверхні злоякісних клітин. Їх фізіологічна функція полягає у сприянні адгезії клітин під час запального процесу, імунної відповіді та загоєння рани. Селектини несуть основну відповідальність за перші кроки адгезії клітин і при їх відсутності всі наступні кроки, які стаються завдяки інтегринам та іншим молекулам адгезії, відбуваються значно пізніше або не відбуваються зовсім. Виявлено експресію селектинів на поверхні лейкоцитів (L-селектин), тромбоцитів (P-селектин) та судинного ендотелію (E- та P-селектин).

Гепарин та гепариноподібні сполуки можуть пригнічувати з’єднування L-селектину та P-селектину з тетрасахаридами на поверхні ракових клітин (Norgard-Sumnicht K. E. et al., 1993; Koenig A. et al., 1998), це зумовлює пригнічення запальної відповіді (Nelson R. M. et al., 1993) і може сприяти розвитку метастазів (Varki N. M. et al., 2002).

4.3. Вплив на гепараназу

Важливий етап процесу інвазії раку та метастазування полягає в розщепленні різноманітних компонентів позаклітинного матриксу, включаючи колаген, ламінін, фібронектин та гепарансульфатпротеоглікани, за допомогою таких ферментів, як макриксні металопротеази, сироваткові протеази, цистеїнові протеази та ендоглікозидази (Nakajima M. et al., 1988; Vlodavsky I. et al., 1990). Гепараназа (фермент із класу ендоглікозидаз) може руйнувати різноманітні компоненти позаклітинного матриксу, сприяючи інвазії пухлини.

Експресія гепаранази в нормальних тканинах незначна, проте її виявляють у багатьох пухлинах, де вона значно підвищує ангіогенез та здатність до метастазування (Vlodavsky I. et al., 2002). Підвищена експресія гепаранази в людей корелює з наявністю пізніх стадій та метастазів пухлин грудної залози, товстого кишківника, яйників, сечового міхура, підшлункової залози, гострого мієлоїдного лейкозу, недрібноклітинного раку легенів та мієломи. Гепараназа відіграє важливу роль у розщепленні гепаран-сульфатних груп гепарансульфатпротеогліканів з утворенням фрагментів молекул, які більше, ніж незмінені гепаран-сульфатні групи, потенціюють активність факторів росту.

Чимало досліджень свідчать про те, що гепарин та деякі хімічно модифіковані похідні гепарину пригнічують активність гепаранази пухлинних клітин, це корелює із зниженням здатності пухлини до метастазування (Irimura T., 1986; Vlodavsky I. et al., 1994; Yoshitomi Y. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996, Ono K. et al., 2002; Nakajima M. et al., 1988; Parish C. R. et al., 1987; Vlodavsky I. et al., 1999; Poggi A. et al., 2002; Miao H. Q. et al., 1999).

4.4. Вплив на гепарансульфатпротеоглікани

Розчинні гепарини конкурують з гепаран-сульфатними групами гепарансульфатпротеогліканів за з’єднання з факторами росту та іншими білками і можуть зумовлювати виділення цих білків з позаклітинного матриксу. НФГ та НМГ in vitro (Parish C. R. et al., 1987) можуть пригнічувати ангіогенез, викликаний β-фактором росту фібробластів, розриваючи зв’язок між цим фактором та гепаран-сульфатними групами. У людей терапевтичні дози НФГ зумовлюють зростання рівня факторів росту, таких як β-фактор росту фібробластів, у сироватці крові (D’Amore P. A., 1992; Folkman J. et al., 1989). Soker S. et al. (1994) довели, що НМГ, на відміну від НФГ, завдяки меншому розміру молекули можуть пригнічувати з’єднання факторів росту з їх рецепторами.

Невеликі фракції гепарину, на відміну від НФГ, in vivo можуть пригнічувати ангіогенез, зумовлений β-фактором росту фібробластів та фактором росту судинного ендотелію (Jayson G. C. et al., 1997).

5. Висновки

Процес метастазування пухлини дуже складний, він включає як механізми, залежні від системи згортання крові, так і механізми, які не залежать від системи коагуляції. Агрегація та активація тромбоцитів, зумовлена пухлинними клітинами, відіграє важливу роль у захисті злоякісних клітин, їх успішній адгезії та інвазії через стінку ендотелію. Результати багатьох досліджень підтримують гіпотезу, що гепарин впливає радше на каскад метастазування, ніж на ріст первинної пухлини. У більшості експериментальних моделей метастазування пухлинні клітини вводили внутрішньовенно у хвостову вену, унаслідок чого розвивалися метастази в легенях. Протягом цього процесу після затримання пухлинних клітин у першій сітці капілярів (легенях) настає активація системи згортання крові завдяки тканинному фактору на поверхні злоякісних клітин, агрегації та активації тромбоцитів. У цьому процесі важливу роль відіграє тромбін, частково незалежний від факторів згортання крові. Гепарини можуть діяти на різні ланки цього процесу.

Оскільки на тваринних моделях хімічно модифіковані гепарини з обмеженою або відсутньою антикоагуляційною активністю також проявляли антиметастатичну дію, протиракова активність гепаринів також може здійснюватися за допомогою механізмів, які не залежать від системи згортання крові (Yoshitomi Y. et al., 2004; Sciumbata T. et al., 1996; Poggi A. et al., 2002; Kragh M. et al., 2005). До таких механізмів належать пригнічення гепарином міжклітинної взаємодії, яку стимулюють селектини; інгібування гепаранази та ангіогенезу; стимуляція виділення інгібітору зовнішнього шляху згортання крові.

Як пояснити дію препаратів, які в основному пригнічують розвиток метастазів, коли протиракова активність гепаринів проявляється і в хворих з уже наявними метастазами? Збільшується кількість доказів того, що продовження процесу метастазування сприяє прогресуванню раку та ще більшій його дисемінації. Доведено, що в більшості онкологічних хворих можна виявити циркулюючі злоякісні клітини (Cristofanilli M. et al., 2004) та що кількість циркулюючих ракових клітин корелює з прогнозом (Cristofanilli M. et al., 2005). На підставі цих даних можна дійти висновку, що у хворих з метастатичним захворюванням припинення метастатичного каскаду за допомогою гепаринів можна сприятливо вплинути на результат лікування захворювання. Це також може пояснити феномен, чому гепарини проявляють протиракову дію в основному в пацієнтів з обмеженим метастатичним захворюванням, але у хворих з термінальною стадією ці препарати неефективні (Klerk C. P. et al., 2005; Kakkar A. K. et al., 2004).

На відміну від цитотоксичної хіміотерапії, коли лікування спрямоване проти самої ракової клітини, гепарини в основному діють на мішені за межами злоякісних клітин. Процес метастазування, очевидно, не є специфічним для різних видів раку і залежить від дії загальних позаклітинних механізмів, тому позитивна дія гепаринів на прогноз не обмежена окремими видами раку.

Проблема протиракової активності гепаринів потребує подальшого вивчення, але однозначно доведено, що лікування гепаринами поліпшує прогноз в онкологічних хворих.

Підготував Богдан Борис

  • * В Україні препарат зареєстворований компанією Пфайзер під назвою Фрагмін.